Ο Agostini ξεκίνησε τη σταδιοδρομία του σε αγώνες hillclimb, τερματίζοντας δεύτερος στην πρώτη του εμφάνιση το 1961 και κερδίζοντας τον πρώτο του τίτλο το 1963 στο Ιταλικό Πρωτάθλημα hillclimb. Αυτές οι επιδόσεις τον οδήγησαν εκείνη τη χρονιά σε μία και μόνο εμφάνιση στο Παγκόσμιο Πρωτάθλημα στη Μόντσα, στην κατηγορία των 250 κ.εκ. και μέχρι το 1964 ο Agostini ήταν ήδη μέλος της εργοστασιακής ομάδας Moto Morini.

Παρά το γεγονός ότι συμμετείχε σε δύο μόνο εκκινήσεις στην κατηγορία των 250 κ.εκ. εκείνη τη χρονιά, προκάλεσε τεράστια εντύπωση και το 1965 έγινε μέλος της ομάδας MV Augusta, αγωνιζόμενος στις κατηγορίες των 350 και 500 κ.εκ. Στην πρώτη του ολοκληρωμένη σεζόν, ο 22χρονος τότε Agostini κέρδισε τέσσερα Grand Prix και τερμάτισε στη δεύτερη θέση και στα δύο πρωταθλήματα.

Ο πρώτος του τίτλος ήρθε την επόμενη χρονιά, στο πρωτάθλημα των 500 κ.εκ., όπου η σταθερή και γρήγορη οδήγησή του αποτέλεσε ένα μικρό μόνο δείγμα όσων θα ακολουθούσαν μέσα στην επόμενη δεκαετία. Εκείνη τη χρονιά κέρδισε επίσης το πρώτο του Isle of Man TT στην κατηγορία των 350 κ.εκ.

Το 1967, στέφθηκε και πάλι πρωταθλητής στην κατηγορία των 500 κ.εκ, αλλά από το 1968 και μετά, ανέβασε τον πήχυ ακόμα πιο ψηλά. Ο Ago κέρδισε κάθε αγώνα Grand Prix από το 1968 μέχρι το 1970 και στις δύο κατηγορίες των 350 και 500 κ.εκ, κερδίζοντας έξι αγώνες Isle of Man TT και ξεπερνώντας όλους τους μεγάλους οδηγούς αγώνων μοτοσυκλετών του παρελθόντος.

Το 1971 και το 1972 του χάρισαν τέσσερις ακόμα τίτλους. Ο Agostini είχε κερδίσει και τα 11 τελευταία πρωταθλήματα στα 350 και 500 κ.εκ. Έχασε το πρωτάθλημα του 1973 στα 500 κ.εκ. αλλά ξαναβρέθηκε στην κορυφή του βάθρου για 13η φορά κερδίζοντας τον τίτλο στην κατηγορία των 350 κ.εκ. Μετά από οκτώ χρόνια αγώνων με τετράχρονη μοτοσυκλέτα, το 1974 στράφηκε στη Yamaha και στον πανίσχυρο δίχρονο κινητήρα της, εντυπωσιασμένος από τις εξελίξεις που είχε δει στις τελευταίες σεζόν.

Ο πρώτος αγώνας του Agostini με τη Yamaha ήταν στο Daytona 200, όπου η εταιρεία είχε επικρατήσει με νίκη τις προηγούμενες δύο χρονιές. Ήταν η πρώτη συμμετοχή του Ιταλού αναβάτη στους διάσημους Αμερικανικούς αγώνες με αντιπάλους όπως ο πρωταθλητής AMA και αγαπημένος Αμερικανός οδηγός, Kenny Roberts.

Στην πίστα των 6 χιλιομέτρων, ο Agostini πήρε την πρώτη του γεύση από τη μοτοσυκλέτα TZ750, πραγματοποιώντας την πρώτη του εμφάνιση με δίχρονο κινητήρα. Πολλοί Ευρωπαίοι φίλαθλοι είχαν ταξιδέψει στο Daytona International Speedway, καθώς ο αγώνας είχε προσελκύσει τη διεθνή προσοχή λόγω της συμμετοχής του Ago.

Ο Agostini βρισκόταν στην πρώτη θέση από την αρχή ακόμα του αγώνα των 320 χιλιομέτρων, αλλά η τεράστια σωματική καταπόνηση που συνεπάγεται ο έλεγχος της μοτοσυκλέτας στις στροφές και σε άλλα σημεία που απαιτούν τεχνική, είχε ως αποτέλεσμα να αναγκαστεί να σταματήσει για λίγο, στη μέση περίπου του αγώνα, λόγω αφυδάτωσης.

Αποφασισμένος να μην απογοητεύσει τους οπαδούς που είχαν ταξιδέψει από τόσο μακριά, ο Agostini ξεπέρασε τον πόνο του και κατέκτησε τη νίκη με διαφορά περίπου 25 δευτερολέπτων από τον Roberts, δίνοντας στη Yamaha την τρίτη συνεχόμενη νίκη της στο Daytona 200 και τοποθετώντας τη διοργάνωση στον παγκόσμιο χάρτη.

Εκείνη τη χρονιά, ο Agostini στέφθηκε πρωταθλητής στα 350 κ.εκ. εκπροσωπώντας τη Yamaha, κερδίζοντας όλες τις διοργανώσεις στις οποίες συμμετείχε, αλλά κάποιοι τραυματισμοί και μηχανικά προβλήματα του στέρησαν τον τίτλο στα 500 κ.εκ. Επέστρεψε το 1975 για να διεκδικήσει το 15ο και τελευταίο του πρωτάθλημα στα 500 κ.εκ. με την YZR500, η οποία είχε κυκλοφορήσει μόλις δύο σεζόν πριν.

Αφού αποσύρθηκε από τους αγώνες Grand Prix το 1977, ο Agostini στράφηκε στους τέσσερις τροχούς και συμμετείχε για δύο σεζόν στο Βρετανικό πρωτάθλημα Formula One, ανεβαίνοντας πολλές φορές στο βάθρο, προτού ασχοληθεί με το μάνατζμεντ της ομάδας της Yamaha το 1982. Κέρδισε τρεις παγκόσμιους τίτλους με τον Eddie Lawson και οδήγησε τους Graeme Crosby, Roberts και Lawson σε νίκες στο Daytona 200.