Agostini começou o seu percurso de competição em eventos de montanha, terminando em segundo lugar na sua estreia em 1961, antes de conquistar o seu primeiro título no Campeonato Italiano de Montanha de 1963. Essa performance levou a uma participação pontual no Campeonato do Mundo de 250 cc em Monza desse ano e, em 1964, já era piloto de fábrica da Moto Morini.

Apesar de só ter feito duas corridas no campeonato de 250 cc desse ano, fez sensação no paddock e foi integrado na equipa MV Augusta para a temporada de 1965, competindo nas categorias de 350 cc e 500 cc. Na sua primeira temporada completa, com 22 anos de idade, venceu quatro Grandes Prémios e terminou em segundo lugar nos dois campeonatos.

O seu primeiro título chegou no ano seguinte, no campeonato de 500 cc, onde a sua velocidade pura e consistência deram um sinal sobre o que viria na próxima década.

Nesse ano, também venceu a Isle of Man TT na categoria de 350 cc.Em 1967, foi novamente campeão de 500 cc, antes de passar a um nível ainda superior a partir da temporada de 1968. "Ago" venceria todas as corridas de Grande Prémio entre 1968 e 1970 nas categorias de 350 cc e 500 cc, vencendo seis corridas Isle of Man TT e superando todos os grandes nomes do motociclismo que o precederam.

1971 e 1972 trouxeram mais quatro títulos, o que significa que tinha conquistado todos os últimos 11 campeonatos de pilotos em 350 cc e 500 cc.

Deixou escapar o título de 500 cc em 1973, mas subiu ao pódio mais alto da classificação pela 13.ª vez depois de conquistar a categoria de 350 cc. Depois de oito anos a competir numa moto a quatro tempos, mudou para a Yamaha e com um motor a dois tempos para a temporada de 1974, impressionado pelos desenvolvimentos que tinha visto nas temporadas recentes.

A primeira corrida de Agostini com a Yamaha seria na Daytona 200, corrida esta que o fabricante tinha vencido nos dois últimos anos. Foi a primeira tentativa do italiano no famoso evento americano e iria enfrentar, entre outros, o campeão AMA em título e favorito do público local, Kenny Roberts.

No circuito de 6,18 km, Agostini daria as primeira voltas com a TZ750, a sua estreia numa máquina a dois tempos. Muitos fãs europeus viajaram até ao circuito de Daytona International Speedway, com a corrida a atrair a atenção mundial por causa da presença de Ago.

Assumiu a liderança logo no início da corrida de 200 milhas, mas a grande exigência física de controlar a moto nas curvas inclinadas e a secção técnica no campo obrigaram-no a parar por breves momentos a meio da corrida devido a desidratação.

Determinado a não desiludir os fãs que tinham viajado para o ver, Agostini superou a dor para conquistar a vitória com cerca de 25 segundos de avanço para Roberts, ajudando a Yamaha a conquistar a sua terceira vitória consecutiva na Daytona 200 e a colocar o evento no mapa mundial.

Nesse ano, Agostini sagrou-se campeão de 350 cc com a Yamaha, tendo vencido todos os eventos que disputou, mas as lesões e os problemas mecânicos fizeram-no perder o título de 500 cc. Regressaria às vitórias em 1975 para conquistar o seu 15.º e último campeonato de 500 cc com a YZR500, que tinha sido apresentada duas temporadas antes.

Depois de se retirar das corridas Grand Prix em 1977, Agostini mudou para as quatro rodas e passou duas temporadas no Campeonato Britânico de Fórmula Um, tendo conseguido subir várias vezes ao pódio, antes de assumir a direção da equipa Yamaha em 1982. Venceu três títulos mundiais com Eddie Lawson e levou Graeme Crosby, Roberts e Lawson a vitórias na Daytona 200.